【五分钟讲实验】PCR实验故障排除方法快速了解！

1. PCR的原理

利用一对DNA引物、耐热DNA聚合酶和核苷酸对特异性基因进行扩增。

2. PCR的基本步骤

基本步骤是将双链DNA变性为单链DNA，与引物退火并延伸DNA链。

① 变性步骤(94℃)：将DNA加热到94℃使其单链。在每个循环中只给这个加热过程1-2分钟。

②  退火(54℃)：温度迅速冷却。在这种较低的温度下，引物与相应的DNA位点快速退火。在Taq聚合酶的帮助下，反应从引物- dna模板位点开始。

③ 延伸(72℃)：互补核苷酸连接在DNA的3 '到5 '端。在每个周期中，基因的数量呈指数增长。在每个PCR中至少进行30个变性-退火-延长循环。

3. PCR的基本要素

①引物：引物是人工制造的DNA链的小片段，实际上是每条目标DNA链3 '端的互补链。引物通常由20-30个核苷酸组成。

②DNA聚合酶(Taq聚合酶)：Taq聚合酶是一种延伸新的DNA链的DNA聚合酶。它在引物末端结合，然后依次在与目标DNA互补的3 '端DNA链上添加新的核苷酸。分离双链DNA需要高温(94℃)。普通的DNA聚合酶在这个温度下会分解。

然而，Taq聚合酶具有在高温下高效工作的独特特性。这种Taq DNA聚合酶是从水热菌中提取的。这些细菌生活在温泉里，可以在那里生存。

③脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)：脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP。这些是新DNA链的原材料或基本构建块。Taq聚合酶从工作溶液中捕获这些dNTPs，并将它们连接到引物的末端以延长DNA链。

④从样品中提取目标DNA:从样品中提取目标DNA。

⑤缓冲溶液:为反应的发生提供了最佳的化学环境。

⑥氯化镁(MgCl2)：氯化镁作为Taq聚合酶的辅助因子。

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