【五分钟讲实验】膝关节骨性关节炎KOA模型各类造模方法详解！

关节炎：泛指发生在人体关节及其周围组织，由严重、感染、退化、创伤或其他因素引起的炎性疾病，可分为数十种。

临床表现为关节的红 、肿 、热 、痛 、功能障碍及关节 畸形 ，严重者导致关节残疾 、影响患者生活质量 。

1. 膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）

① 是种常见慢性病，正在成为世界范围内最常见的慢性退行性关节疾病之一。 

② 是由于膝关节的退行性改变和慢性积累性损伤，引起的膝关节软骨变性，关节增生，骨刺形成等病理改变，以膝关节疼痛、运动受限为主要临床症状的一种病症，又称“退行性膝关节炎”、“增生性膝关节炎”。属于中医上“骨痹”范畴。 

③ 特点是关节软骨破坏和关节边缘骨质改变。

2. 膝关节骨性关节炎的病因

① 长期负重：长期姿势不良，负重用力，体重过重，导致膝关节软组织损伤。体重的增加和膝骨性关节炎的发病成正比。

② 慢性劳损：经常的膝关节损伤，如骨折、软骨、韧带的损伤。当关节承受肌力不平衡并加上局部压力，就会出现软骨的退行性变。在骨质疏松者出现骨性关节炎的几率就增多。

③ 遗传因素：不同种族的关节受累情况是各不相同的，性别亦有影响，本病在女性较多见。

3. 膝关节骨性关节炎的临床表现

① 发病缓慢，多见于中老年肥胖女性，往往有劳累史。

② 膝关节活动时疼痛加重，其特点是初起疼痛为阵发性，后为持续性，劳累及夜间更甚，上下楼梯疼痛明显。

③ 膝关节活动受限，甚则跛行。极少数患者可出现交锁现象或膝关节积液。

④ 关节活动时可有弹响、磨擦音，部分患者关节肿胀，日久可见关节畸形。

⑤ 膝关节痛是本病患者就医常见的主诉。其早期症状为上下楼梯时的疼痛，尤其是下楼时为甚，呈单侧或双侧交替出现，是出现关节肿大，多因骨性肥大造成，也可关节腔积液。

① 影像学评价

•X 线检查诊断人KOA 的首选方法，可显示关节间隙变窄、软骨下骨硬化、骨赘及骨囊肿 形成等 KOA 典型病理变化，其临床应用广泛。

•电子计算机断层扫描（CT）评估 KOA 动物模型的骨特征。 

•磁共振成像（MRI）在KOA动物模型中，MRI 检查可显示软骨、半月板、韧带和滑膜等组织病变，并可对骨结构及软骨组成物质进行量化分析。

•超声检查可显示关节内软组织情况，可用于评估 KOA 动物模型的滑膜炎症、关节积液和软骨及半月板损伤等病变。

② 症状评价

•KOA的主要临床表现包括疼痛及功能障碍。

动物模型 KOA 发生发展时，动物也会出现相应症状。因此，评估动物的症状可以评价建模效果。 

③ 关节镜评价 

•关节镜检查系采用微创方法发现关节腔内软骨、半月板、韧带和滑膜病变，在临床上应用广泛，也可用于KOA动物模型评价。 

④ 生物标志物评价 

•KOA 病变过程中，软骨、骨及滑膜组织的多种生物标志物会出现变化。

⑤ 组织病理学评价 

•大体观察组织染色（关节软骨HE染色、关节软骨番红O-固绿染色、Masson 染色）

1. 造模方法

大鼠按剂量腹腔注射10%的水合氯醛进行麻醉，常规备皮消毒膝关节，取左髌旁内侧切口显露膝关节，切开关节囊，打开关节腔，将髌骨向外侧脱位，尽量屈曲膝关节显露前交叉韧带，在直视下用小尖刀切断前交叉韧带，行抽屉试验确定前交叉韧带断裂，术中不损伤软骨面，彻底止血，将髌骨复位，逐层关闭切口。

对照组作为假手术组，经同样方式进入膝关节，切开关节囊，打开关节腔，将髌骨脱位，屈曲膝关节显露前交叉韧带，不切断交叉韧带，然后复位髌骨，闭合关节腔。术后大鼠不做任何固定措施，每日肌注青霉素 40 万 U 一次，连续 3 d。

2. 抽屉试验

① 是检查前交叉韧带损伤方法

② 操作：将大鼠膝关节屈曲 90 度，检查者以一手握住大腿，另一手握小腿上段做向前拉及后推的动作。观察胫骨结节明显向前移位则为阳性，前交叉韧带已被切断。

3. 评价指标

① 抽屉实验：造模过程中验证。 

② 软骨面宏观评分：内侧胫骨平台软骨面进行评分并拍照。 

③ 实验动物的一般观察 ：精神状态、进食情况、活动情况等。 

④ 细胞因子检测：TNF-α、IL-6 以及 MMP-13。 

⑤ 病理检测：检验病理变化程度（HE及番红O固绿染色） 

⑥ 影像学检查：MRI、X射线等。

4. 模型特点

① 大鼠状态：术后第 1 d，前交叉韧带切断组:精神状态及进食饮水较差，活动明显减少，术后第 3 d 实验组动物精神状态及进食良好，开始自由活动，切口未见明显感染症状。

② 关节软骨宏观损伤情况：对照组的胫骨平台关节面光滑有光泽，关节囊结构正常。ACLT组的内侧胫骨平台软骨面可见明显的损伤迹象，关节面不光滑，软骨表层可见侵蚀表现，光泽度变差，损伤区软骨面呈浅灰白色，周围关节囊和软组织可见肥厚增生。

③ 病理结果：对照组可见膝关节软骨表面光滑规整，未见明显裂隙。细胞排列规整，未见细胞增加或减少，基质染色尚显正常，潮线完整，各层分解清晰。模型组可见关节软骨表面轻度破坏，软骨层破坏较严重，略有裂隙， 偶有部分缺损，软骨细胞未见增加或减少，基质染色尚正常，潮线完整性变差。

④ 炎性因子水平：与对照组比较，模型组大鼠血清和关节液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平显著升高， MMP-13 强阳性表达。

1. 造模方法

用 30 g /L 戊巴比妥钠按 30 mg / kg 量行腹腔麻醉，常规备皮消毒膝关节，取左髌旁内侧切口显露膝关节，切开关节囊，打开关节腔，将髌骨向外侧脱位，尽量屈曲90°，切除半月板，切除半月板后，用生理盐水冲洗关节，止血后再缝合。

2. 评价指标

① 大鼠膝关节大体形态学观察。 

② 病理染色检验病理变化程度（HE及番红O固绿染色）。 

③ 免疫学参数：关节液及血清炎性因子水平的检测， TNF-α、IL-6、MMP-13 水平。

④ 半月板损伤MRI分级。

3. 模型特点

① 与假手术组比较,模型组大鼠关节液 TNF-α、IL6、MMP-13 水平显著升高。

② 假手术组大鼠关节软骨表面光滑、形态完整,基质内细胞排列整齐、分布区域均匀、层次清晰。模型组大鼠关节软骨缺损和形态破坏明显,软骨基质降解随处可见,软骨细胞大量丢失,并且出现肥大性退变。

1. 造模方法

① SD大鼠适应性喂养 1 周，分为正常组和造模组 。大鼠膝关节内侧入路，切断内侧副韧带、前交叉韧带，摘除内侧半月板 。 

② 术后连续 3 d 肌肉注射青霉素 20 万 U 预防感染。手术伤口愈合后开始每天强迫大鼠活动 0.5 h，连续 2 周。

2. 评价指标

① 大鼠一般情况：精神状态、进食情况、活动情况等。 

② 大鼠膝关节 MRI 观察：拍摄膝关节 MRI，观察 KOA 进展情况。 

③ 病理染色：检验病理变化程度（HE及番红O固绿染色）。 

④ ELISA法测定IL-1、IL-6、 TNF-α及MMP-3。

3. 模型特点

① 各组大鼠一般情况：假手术组大鼠状态良好， 模型对照组大鼠术后 1 周出现自主活动减少、活动受限等现象，1 周左右活动逐渐恢复正常。实验结束后，假手术组大鼠膝关节外观形态正常， 髌骨及髌韧带形态正常。模型组膝关节肿大较明显，侧面可见瘢痕增生组织形成。

② 各组大鼠膝关节 MRI 观察：假手术组可见关节间隙正常，内外侧半月板结构完整，股骨髁和胫骨平台关节面平整。模型对照组关节间隙增宽，内侧半月板缺如，关节软骨面不平整、软骨层变薄、 局部缺损，结缔组织增生，形成明显骨赘，关节肿胀、积液明显，模型制作成功。

③ 软骨组织的HE染色显示：假手术组关节软骨表 面相对光滑完整，层次分明，结构完整；软骨细胞分布均匀，大小适中，无双核现象出现，潮线清晰可见。模型对照组关节软骨表面出现缺损，层次紊乱，结构破坏；软骨细胞形态异常，变小，分布紊乱， 较多双核现象；潮线不清晰，扭曲或中断；呈现典型骨关节炎性改变。

1. 注意事项

① 熟悉膝关节的解剖结构明确前交叉韧带、半月板、内侧副韧带的具体位置。

② 确保前交叉韧带、内侧副韧带全部剪断、半月板全部摘除。

③ 注意无菌操作，防止手术感染，避免手术时对关节面的损伤。手术后每天强迫大鼠运动1小时，加速模型进程。

④ 从技术上讲，麻醉后要在皮肤上准备局部杀菌剂，并在右膝盖关节的侧面横向切开皮肤。注意术中不损伤软骨面。

⑤ 要避免侵入性操作伴随的感染及并发症，减少误差对实验结果的影响。需注意有创操作带来的额外损伤及可能的感染所引起的混淆效应。

⑥ 连续 3 天予以青霉素肌注及伤口碘伏消毒预防感染。

⑦ 取材注意保持关节囊完整，得到完整的右膝关节，在显露关节面的过程中注意小心操作，不可划伤软骨组织，避免撕扯以防损伤软骨结构。生理盐水冲净关节面后用纱布轻轻擦干。

⑧ 打开关节腔，稍有疏忽发生不洁物品的沾染，组织碎渣及动物毛发的关节囊内存留等情况，容易发生感染。

⑨ 手术操作要轻柔准确，在切除半月板时要注意避免损伤关节软骨。

2. 风险评估

① 切断前交叉韧带、内侧半月板时，尤其在处理半月板时，要完整取出，因其位置软深，扩大关节间隙有一定限度，常不能满意显露，操作有一定困难，易造成其他的结构的损伤。

② 低幅高频振动及患肢负重锻炼均可加速ACLT诱导的大鼠OA进程、缩短实验周期。

③ 造模的稳定性需要关注，由于有创操作带来的额外损伤以及可能的感染所引起的混淆效应。

④ 手术诱导的骨关节炎模型进展快，效果明显，是短期研究的最佳选择。但是手术会干扰其他关节组织，可能影响疾病的进展；也会造成额外的创伤，有感染的风险。

⑤ 手术可能引起炎症、疼痛，造成额外的损伤。

⑥ 手术操作人员的熟练度不同，会造成不同的关节内损伤，影响到后期骨关节炎的严重程度。造成不同实验所造成的骨关节炎严重程度不一致，对照困难。

⑦ 在没有高运动负荷的情况下，单纯的前交叉韧带横断手术造模仅能在基因层面观察到明显差异，可能不适用于对骨关节炎宏观上的研究；前交叉韧带横断联合内侧半月板失稳的造模方案则可以在低运动负荷的情况下宏观上满足大部分针对炎症调控及软骨修复研究的实验要求。

1. 自然诱发模型模拟了 KOA 发病的真实过程，可以研究软骨、滑膜、炎症因子等多方面内容，但其实验周期长，成本高。手术诱发模型 稳定性好，成功率高，需要技术成熟的实验人员参与全过程，且其诱发的模型因损伤较大，多为中晚期 KOA 表现，不适合对早期 KOA 进行研究。

2.药物注射诱发方式选择较多，其操作简单易行，造模时间短，适用于药物疗效和筛选的研究。

3.关节制动和寒冷刺激诱发方式安全、操作简单，可以较好的模拟 KOA 自然发病过程，进行药效学和作用机制的深入研究。

4.关节撞击可以模拟各种创伤和运动损 伤而引起的关节炎症，其避免了手术高感染风险。

5. 膝骨性关节炎机制研究：通过模拟关节炎模型，研究关节炎的发病机制。——科研终端客户

6. 新药物筛选：评估候选药物对膝骨性关节炎疾病的潜在疗效，寻找治疗靶点和药物。——药企药效实验、科研终端客户

7. 免疫学研究：研究免疫细胞、免疫因子和免疫通路在膝骨性关节炎发病中的作用，以揭示免疫性关节炎疾病的机制。