【五分钟讲实验】不同血友病模型对比及案例分析！

1. 实验方法

① 基因敲除（Knockout）

技术：CRISPR/Cas9或同源重组靶向删除特定外显子（如F8 exon 16/17）。

应用：小鼠血友病A/B型。

② 转基因（Transgenic）

技术：显微注射人类突变基因（如R539C、HLAD28/1*1501）至胚胎干细胞或受精卵。

应用：模拟人类错义突变。

③ 敲入（Knock-in）

技术：靶向插入特定突变（如R33Q、G581E）至内源基因位点，保留表达框架。

应用：研究CRM+/-表型。

④ 自然突变模型

技术：筛选自然发生的突变个体（如犬外显子22倒位）。

应用：犬血友病A型（Graham等, 1949；Hough等, 2002）。

2. 实验材料

动物品系：小鼠：C57BL6、BALB/c、C3H等近交系；犬：Chapel Hill、Queen品系。

基因工具：CRISPR/Cas9系统、重组载体、胚胎干细胞（传统方法）。

突变类型：外显子倒位、错义突变（R539C）、提前终止密码子。

3. 造模后验证与检测

3.1 病理检测

① 凝血功能评估：

APTT（活化部分凝血活酶时间）：显著延长（正常值：25-35秒；模型可达>60秒）。

凝血因子活性（FVIII:C/FIX:C）：ELISA或发色底物法检测，重型模型活性<1%。

② 出血表型观察：

尾部出血时间：小鼠>10分钟（正常<2分钟）。

自发性出血：关节肿胀（犬模型）、肌肉血肿（绵羊模型）。

3.2 分子蛋白检测

① 基因型验证：

PCR扩增+Sanger测序：确认外显子敲除或突变位点（如L176P）。

Southern blot：用于大片段缺失或倒位检测（如犬外显子22倒位）。

② 蛋白表达分析：

Western blot：检测FVIII/FIX蛋白缺失（敲除模型）或异常大小（突变模型）。

ELISA：定量血浆凝血因子水平（CRM+模型可能显示正常抗原但无活性）。

③ CRM状态鉴定：

交叉反应抗体：CRM+（蛋白存在但无功能，如R33Q）；CRM-（蛋白完全缺失，如G379E）。

1. 品系选择：C57BL6小鼠免疫耐受性强，适合基因治疗；BALB/c易产生抗体，适合免疫研究。

2. CRM分类：CRM+模型需结合功能实验（如凝血活性检测）明确表型。

3. 自然突变模型：犬外显子22倒位与人类重型血友病A高度相似，是金标准模型。

通过系统选择模型，可针对不同研究目标（机制探索、治疗开发、长期安全性）优化实验设计。

关于晶莱

晶莱生物创立于2016年，拥有北京(北京晶莱华科生物技术有限公司)及长沙(湖南晶莱生物技术有限公司)两个研发机构，是专注于生物医药临床期前研发与基础医学科研服务的国家高新技术企业及专精特新企业。依托北京、长沙两地的3000余平实验平台，晶莱构建了8个研究平台，可为客户提供包括临床前CRO、动物寄养、动物模型构建、细胞型构建、药效及各类表型、机制、通路等全方位的研究服务。

截至目前，晶莱生物已与国内超过500家生物医药公司、高校及医院建立了紧密的合作关系，成功实施了10000余项研究/研发项目，积累了超过100000+客户。