使用人诱导多能干细胞来源的类器官模拟 T 细胞介导的自身免疫性垂体疾病

本研究首次为细胞毒性T细胞（CTL）直接驱动抗PIT-1垂体炎的发病机制提供了确凿证据。为解决HLA匹配的关键问题，研究人员利用诱导多能干细胞（iPSC）技术，构建了携带患者特定HLA单倍型的垂体类器官。当将这些类器官与患者来源的PIT-1反应性CTL共培养时，仅在自体条件下观察到了针对PIT-1阳性垂体细胞的特异性杀伤，且该细胞毒性可被免疫抑制剂（如地塞米松和环孢素A）所抑制。

研究还发现该疾病的致病机制涉及多种表位、CTL克隆和HLA分子组合。这项工作不仅证实了CTL介导的自身免疫是抗PIT-1垂体炎的致病核心，也为研究其他T细胞介导的自身免疫病提供了可推广的新策略。

1. 研究背景与问题提出

① 疾病定义：抗PIT-1垂体炎是一种特殊的自身免疫性垂体炎，特征为获得性GH、TSH、PRL缺乏，并与表达PIT-1的恶性肿瘤相关。

② 核心假设：疾病由针对PIT-1的自身免疫导致，其机制被认为是T细胞介导的免疫，而非自身抗体。

③ 现存挑战：

直接证据缺乏：虽然怀疑细胞毒性T细胞（CTL）是元凶，但缺乏直接的功能性证据。

模型瓶颈：动物模型无法完美匹配人类特有的HLA单倍型，而HLA是T细胞抗原识别的关键，这限制了疾病机制的精准研究。

技术机遇：iPSC技术能够生成携带患者特定HLA背景的靶细胞（如垂体细胞），为在自体环境下研究自身免疫提供了独特平台。

2. 研究核心目标

① 首要目标：直接证实PIT-1特异性CTL在抗PIT-1垂体炎中的致病作用。

② 技术目标：利用患者来源的iPSC，建立一种能再现疾病关键特征的体外人类疾病模型。

③ 机制目标：鉴定导致该疾病的特定T细胞受体（TCR）、表位和HLA组合。

④ 应用目标：利用该模型进行治疗药物的测试与评估。

3.  研究方案与技术路线

① 模型构建：

靶细胞端：从患者获取体细胞，重编程为iPSC，并将其定向分化为垂体类器官（表达PIT-1的靶细胞）。

免疫攻击端：从同一患者的外周血中分离出PIT-1反应性CTL。

② 机制验证：

设置异体HLA不匹配的对照组，以证明杀伤的特异性。

观察是否仅在与自体CTL共培养时，出现PIT-1阳性细胞的特异性损伤。

共培养实验：将自体iPSC来源的垂体类器官与自体的PIT-1反应性CTL进行共培养。

特异性验证：

干预验证：加入免疫抑制剂（如地塞米松、环孢素A），观察是否能抑制CTL的细胞毒性。

③ 深度解析：

鉴定被CTL所识别的具体PIT-1表位。

分析参与该过程的T细胞受体（TCR） 序列。

明确提呈这些表位的HLA分子类型。

得出结论：该疾病是由多种TCR-表位-HLA组合共同驱动的。

研究结果与结论

1. 抗 PIT-1 垂体炎患者的反应性 CTL 和 TCR 分离

本研究从患者体内分离出了致病性的PIT-1反应性CTL，并精确地鉴定出其识别的抗原表位（位于OP30区域内）以及负责此次识别和攻击的关键TCR（TRAV4/TRBV7-1），为深入理解该自身免疫病的机制及潜在的特异性治疗奠定了基础。

2. 从患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）中再生功能性表达PIT-1的垂体细胞

① 成功分化与特异性标志物表达：使用SFEBq方法，iPSC可有效分化为垂体细胞。这些细胞在分化过程中正确表达了垂体祖细胞标志物（如LHX3/2、E-钙粘蛋白），并最终分化出表达PIT-1（垂体特异性转录因子）的细胞。

② 基因编辑报告系统验证：通过CRISPR-Cas9技术将GFP报告基因精准敲入PIT-1基因位点，构建了PIT-1GFP 报告细胞系。这使得我们能够直观地追踪和定位活的PIT-1阳性细胞，这些细胞主要位于类器官的外层。

③ 激素生成功能证实：免疫荧光染色显示，分化的PIT-1阳性细胞能够进一步成熟，并产生垂体激素，如生长激素（GH）。定量分析表明，大部分PIT-1阳性细胞同时表达GH。

④ 功能性分泌验证：最关键的功能性实验证明，这些垂体类器官能够向培养上清液中基础分泌GH。更重要的是，在受到下丘脑释放激素（GHRH）的刺激后，类器官的GH分泌量显著增加，这充分证明了其具备生理水平的激素合成与受调控分泌功能。

3. 共培养iPSC衍生的垂体类器官和反应性CTL

此部分研究成功地在体外重现了抗PIT-1垂体炎的自身免疫攻击场景，从激活、浸润到最终杀伤，完整地证明了患者来源的PIT-1反应性CTL是导致垂体细胞损伤的直接执行者。这为该疾病的T细胞介导发病机制提供了毋庸置疑的直接证据。

① CTL的特异性激活：

仅在自体共培养（患者CTL + 患者iPSC垂体类器官）中观察到反应性CTL被激活（通过4-1BB表达证实）。

在异体共培养中则无此现象，证明了免疫识别的HLA限制性。

② 细胞毒性分子表达上调：

qRT-PCR分析显示，仅在自体条件下，CTL的关键效应分子基因（IFN-γ, 颗粒酶B, 穿孔素-1）表达显著上调，表明CTL进入了功能性的杀伤状态。

③ CTL的浸润与靶向聚集：

免疫荧光显示，CTL能够特异性浸润到自体垂体类器官中，并紧密聚集在PIT-1阳性细胞周围。

④ 靶向细胞凋亡的直接观察：

发现PIT-1阳性细胞与凋亡标志物裂解的Caspase-3 共定位，且仅出现在自体条件下，证明PIT-1阳性细胞正在被特异性诱导凋亡。

延时成像提供了最直观的动态证据：可清晰地看到CTL主动追踪、接触并最终导致PIT-1阳性细胞碎裂死亡的整个过程。

4. 确认 PIT-1 反应性 CTL 激活的 HLA 限制并寻求潜在的治疗策略

① 确认了疾病相关的特定HLA分子

病例1:通过基因过表达、四聚体结合和抗体阻断实验，共同证实其PIT-1反应性CTL（Vβ7.1 CTL及其TCR克隆TRAV16/TRBV4-1）的识别严格受 HLA-A*24:02 分子的限制。

病例2:实验确定其PIT-1反应性CTL（Vβ8 CTL）的识别则受 HLA-A*02:01 分子的限制。

这表明，尽管患有同一种疾病（抗PIT-1垂体炎），但不同患者体内的自身免疫反应可能由不同的HLA分子所主导。

② 提供了多维度的确凿证据

功能性激活实验：只有在同时提供PIT-1抗原（OP30肽）和相应HLA分子（如HLA-A*24:02）的靶细胞存在时，CTL才会被强烈激活。

直接结合证据：使用HLA-A*24:02四聚体技术，直接观察到病例1的CTL能够特异性结合由该HLA分子呈递的PIT-1抗原，这是T细胞抗原特异性的“金标准”证明。

抗体阻断实验：加入抗HLA I类抗体可以剂量依赖性地抑制CTL的激活，从功能上反向证明了其激活绝对依赖于HLA I类分子。

5. 抗PIT-1垂体炎的治疗筛查模型

① 药物有效抑制CTL功能：

在CTL与靶细胞共培养的体系中，加入地塞米松（Dex）、环孢素A（CsA） 或抗HLA I类抗体，均能显著降低CTL的激活水平（通过4-1BB表达评估）。

② 药物有效阻止CTL的浸润与杀伤：

阻止CTL浸润：显著减少了CTL向垂体类器官内部的迁移和聚集。

抑制细胞凋亡：显著降低了垂体类器官中PIT-1阳性细胞的凋亡（通过裂解的Caspase-3信号减弱证实）。

在iPSC垂体类器官与自体CTL的共培养模型中，这些药物同样显示出强大的保护作用：

③ 疗效比较与潜在意义：

抗HLA I类抗体表现出最强的抑制效果，这与其直接阻断抗原提呈这一初始环节的作用机制相符。

经典的免疫抑制剂地塞米松和环孢素A也被证明有效，这为使用现有药物治疗该疾病提供了实验支持。

总结：

本研究成功地建立了一种针对抗PIT-1垂体炎的创新型人类iPSC疾病模型。该模型的核心突破在于，首次将患者来源的iPSC（用于生成靶组织） 与从同一患者体内分离出的致病性细胞毒性T细胞（CTL） 相结合，在严格自体HLA匹配的条件下，完整地重现了T细胞介导的自身免疫攻击全过程。

【参考文献】

Modeling of T cell-mediated autoimmune pituitary disease using human induced pluripotent stem cell-originated organoid. Keitaro Kanie, Takeshi Ito, Genzo Iguchi, Ryusaku Matsumoto, Keiko Muguruma, Shin Urai, Shuichi Kitayama, Hironori Bando, Masaaki Yamamoto, Hidenori Fukuoka, Wataru Ogawa, Shin Kaneko & Yutaka Takahashi .Nature Communications volume 16, Article number: 7900 (2025)