【五分钟讲实验】巨噬细胞提取与培养！

1. 巨噬细胞介绍：

巨噬细胞是广泛分布的先天免疫细胞，具有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象，其凭借高度的可塑性和功能多样性，在抵御病原体感染、清除细胞碎片、调控炎症反应、促进组织修复等过程中发挥着不可替代的作用。同时，其功能失调与感染性疾病、自身免疫病、肿瘤、心血管疾病及神经退行性疾病等多种重大疾病密切相关。

2.原代巨噬细胞提取

① 腹腔巨噬细胞提取：

C57小鼠脱颈处死后75%乙醇清洗腹部，剪去腹部皮肤，暴露腹腔，腹腔注射5 mL预冷PBS轻揉数次，抽出灌洗液，反复注入抽吸3次。收集灌洗液，离心（350 g, 4°，5 min）弃上清，使用含双抗的PBS清洗一遍，离心（350 g, 4°，5 min）去除上清，将细胞重悬于1640培养基（含双抗，10%FBS，20 ng/mL M-CSF）中。铺于孔板中培养，培养箱孵育过夜，PBS清洗去除悬浮细胞，收集贴壁细胞，获得巨噬细胞。

② 骨髓巨噬细胞提取：

使用剪刀从膝关节以下切断胫骨，从髋关节附近切断骨盆，取出完整的股骨，使用干净纱布去除骨骼表面的肌肉组织，将处理干净的胫骨和股骨置于含有无菌PBS的离心管中，置于冰上保存，在生物安全柜内将胫骨和股骨在 75%乙醇中浸泡1 min进行消毒，使用 1640培养基冲洗去除残余乙醇，取0.5 mL离心管（底部用18G针穿孔）套在1.5 mL离心管上，用无菌剪刀剪断骨头一端的骨骺后放在0.5 mL离心管中，加入100 µL 1640培养基（一端剪开后，开口朝下，置入离心管中），离心（2000 g, 1 min）获得骨髓细胞，70 μm滤器过滤，离心（300 g，5 min），加入2 mL红细胞裂解液2-5 min，加入10 mL PBS，离心（350 g, 4°，5min），1640培养基（含双抗，10%FBS，20 ng/mL M-CSF）重悬，铺于孔板中培养，培养箱孵育过夜，PBS清洗去除悬浮细胞，收集贴壁细胞，获得巨噬细胞。

3. 巨噬细胞消化方法

巨噬细胞使用常规的消化方法细胞活力低。

消化方法：弃去培养基，加入1 mL 4℃预冷的PBS清洗，重复三次，加入适量胰酶消化3-5 min（消化期间时常观察细胞状态），加入等体积1640完全培养基终止消化，使用移液枪轻轻吹打细胞，收集细胞悬液备用。(此方法细胞活力平均为83%。)