转染后效率低、细胞长不好？90% 的坑都藏在这些操作细节里

做质粒过表达、siRNA敲低等实验时，转染是很常见的一步。但同样的试剂和核酸，有时效率很高，有时却出现细胞大量变圆、脱落，或者细胞状态正常但几乎没有表达效果。

转染结果不仅取决于试剂本身，转染前的细胞状态、铺板密度，转染中的核酸用量和复合物制备，以及转染后的培养时间都会影响最终结果。

转染是将DNA、RNA等外源核酸导入真核细胞的技术，包括脂质体、电转等多种方式。实验室常见的瞬时转染多采用脂质体试剂，通过形成核酸-脂质复合物促进核酸进入细胞。

1.质粒DNA转染主要用于外源基因表达。 

转染成功后需要完成DNA进入细胞、转录和翻译，因此通常在转染后24～48 h或更晚检测目标蛋白，不同载体和目标蛋白需要单独确定时间窗口。

2.siRNA转染主要用于短期基因敲低。 

siRNA用量不能直接照搬质粒DNA条件，也不能默认100 nM就是通用浓度。以Lipofectamine RNAiMAX为例，Silencer Select siRNA推荐从5～10 nM开始，其他siRNA产品的推荐范围会随化学类型和细胞不同而变化。

图2｜质粒转染后GFP报告基因表达

1. 转染时保持70%～90%左右的融合度

细胞太稀容易增加转染毒性，过度融合又可能降低转染效率。以Lipofectamine 3000为例，官方建议转染时贴壁细胞达到70%～90%融合度。Promega的转染优化建议同样强调使用活跃增殖的细胞，并避免过度融合。

Lipofectamine 3000给出的贴壁细胞铺板参考量为：

这些数值适合作为建立新体系时的起点，正式铺板量还要结合细胞大小和增殖速度调整。

2. 细胞活率和传代状态比“多加一点试剂”更重要

转染前的细胞应该处于稳定、活跃的增殖状态。用于转染优化的细胞活率尽量高于95%，同时关注传代次数，因为过高或过低的传代状态都可能增加实验波动。

如果细胞已经出现大量颗粒、贴壁变差、增殖明显减慢或存在支原体污染，应先解决细胞状态问题，再进行正式转染。

3. 无血清只用于复合物制备，不代表细胞必须无血清培养

“转染一定要换成无血清培养基”并不是通用规则。以Lipofectamine 3000为例，DNA和脂质体需要在Opti-MEM等无血清体系中形成复合物，但形成后的复合物可以直接加入含血清或不含血清的细胞培养液中。

因此，对于对无血清环境敏感的原代细胞或难培养细胞，没有必要为了转染机械地长时间撤掉血清。

1. 质粒先保证纯度，再讨论用量

高DNA浓度不能弥补质粒质量差。转染用质粒应尽量保持较高纯度并降低内毒素水平，Promega给出的DNA纯度参考为A260/A280约1.7～1.9。低质量质粒可能同时降低表达效果并增加细胞毒性。

2. Lipo3000可以直接从官方两档条件开始预实验

Lipofectamine 3000官方并没有要求先猜一个“最佳比例”，而是建议新体系同时测试两档试剂量。

选择条件时同时看表达效率和细胞状态。如果增加Lipo3000后阳性率只提高少量，但细胞死亡明显增加，就没有必要继续选择更高剂量。

如果使用Lipofectamine 2000，则常用DNA（μg）∶Lipofectamine 2000（μL）从1∶2～1∶3开始，不能直接套用Lipo3000的体积。

3. siRNA优先做浓度梯度，不直接从高浓度开始

siRNA浓度过高可能增加脱靶和细胞毒性。以RNAiMAX和Silencer Select siRNA为例，可以从5～10 nM作为起始条件；如果使用其他siRNA体系，再根据产品和细胞类型扩大优化范围。

判断最佳浓度时，不只看mRNA敲低率，还应同步观察细胞形态和活率。

图4｜不同转染试剂用量对GFP转染效果的影响示例

1. DNA和脂质体分别稀释后再混合

以Lipofectamine 3000为例，DNA与P3000先在Opti-MEM中稀释，Lipo3000单独稀释，再将两部分按1∶1体积混合，室温孵育10～15 min形成复合物。

同批实验应保持相同的稀释液、混合顺序和复合时间，避免第一孔静置10 min、最后一孔已经放置半小时。

2. 复合物形成后轻柔混匀即可

形成后的复合物不需要反复剧烈吹打。分孔时保持混合均匀，并尽量避免大量气泡。加入培养孔后轻轻前后晃动培养板，使复合物均匀分散，减少局部试剂浓度过高造成的细胞损伤。

图5丨Lipofectamine 3000 试剂使用方案步骤概要

1. Lipo3000不要求固定4～6 h换液

转染后换液不是所有脂质体体系的必做步骤。Lipofectamine 3000官方明确说明，转染后不要求去除复合物或更换培养液。

如果细胞状态稳定，可以继续培养至检测时间点；如果是原代细胞、敏感细胞，或者加入复合物后较快出现明显圆缩、脱落，则可以单独设置提前换液条件进行优化。

2. Lipo2000出现毒性时可比较4～6 h换液

Lipofectamine 2000同样不强制要求换液，但官方Protocol允许在转染后4～6 h更换培养液。对于转染效率尚可、但细胞毒性明显的体系，可以比较“不换液”和“4～6 h换液”两个条件，再根据细胞状态确定方案。

3. 检测时间跟着实验目的走

质粒有表达不等于目标蛋白已经达到最佳检测时间。Lipofectamine 2000的质粒转染Protocol常在18～48 h检测表达，而Lipofectamine 3000官方流程给出的分析窗口可延长至转染后2～4天。

首次实验可以比较24 h和48 h；如果目标蛋白表达较慢，再继续延长。siRNA则需要结合mRNA和蛋白半衰期确定检测节点。

六、结果不好，按实验现象反推参数

脂质体转染真正需要稳定的是一整套条件，而不是某一个“万能配比”。

转染前先把细胞状态和融合度控制好；转染中确定核酸量、脂质体用量和复合时间；转染后再根据细胞耐受性和实验目的决定是否换液以及什么时候检测。

对于新细胞或新核酸体系，先用小规模梯度确定一个“表达效果稳定，同时细胞状态可接受”的实验窗口，比机械增加质粒或转染试剂更有效。

参考资料

1. Thermo Fisher Scientific. Lipofectamine™ 3000 Reagent Protocol.

2. Thermo Fisher Scientific. Lipofectamine™ 2000 Transfection Protocol.

3. Thermo Fisher Scientific. Lipofectamine™ RNAiMAX Transfection Guidance.

4. Promega. Optimize Transfection of Cultured Cells.