人表皮类器官模型构建

类器官是利用成体干细胞或多能干细胞在体外进行3D培养以形成具有近似器官功能和组织结构，具有一定极性的多细胞结构。当前虽已研发出多种皮肤模型，但是体外模型可用的皮肤细胞来源较少，尤其是角质细胞，并且以目前的技术很难在体外培养扩增皮肤细胞。

一、人类器官重组表皮模型

晶莱生物以皮肤组织来源的表皮类器官为基础，构建了结构和功能与人体皮肤非常相似的三维表皮模型，可实现药物、化妆品原料及配方等的体外科学检测。

二、模型构建

三、操作前准备

1. 离心机温度设定为 4℃预冷；

2. 加样枪头提前放置-20 ℃预冷，于加样前取出；24 孔板提前放入 37℃恒温培养箱预热；  

3. 15mL 无菌离心管用润洗液润洗后置于冰上预冷；

4. 将完全培养基从冰箱中取出，将温度平衡至室温； 

5. DPBS 置于冰上预冷；

四、人类器官重组表皮模型构建

1. 取出培养板，在生物安全柜中沿孔边缘吸去培养基；

2. 每孔加入预冷的 500 μL DPBS，使用移液器吸头划胶使基质胶从板底脱落，使用无菌一次性吸管将类器官转移至 15 mL 离心 管；（注：无菌一次性吸管、移液器吸头、离心管等使用前需润洗； ） 

3. 用预冷 DPBS 定容，吹打混匀，使类器官从基质胶中洗脱出来； 

4. 4℃，400 x g，离心 5 min；离心结束弃上清，保留沉淀；加入新的预冷 DPBS 6 mL, 1 mL枪头吹打混匀 20-30 次；  

5. 4℃，400 x g，离心 5 min； 离心后弃去上清，保留沉淀，向离心管中加入 2 mL类器官消化液，37℃消化 7 min 后用 1 mL枪 头吹打混匀 10-20 次，再次37℃消化 7 min，用预冷 DPBS 定容至 6 mL；（注：消化并吹打结束后可取样镜下观察消化情 况，以类器官消化成单个细胞为宜；弃上清时操作要小心，避免吸液时类器官丢失；） 

6. 4 ℃，400 x g，离心 5 min，离心后弃去上清，保留底部沉淀； 

7. 加入预热的人表皮类器官培养基重悬沉淀； 

8. 对表皮类器官单细胞计数，并使用人表皮类器官培养基调整体积为100 μL/模型;（注：建议每个模型接种1.65 x105 个细胞；） 

9. 在培养板中每孔添加预热的800 μL人表皮类器官培养基，嵌入皿内层添加100 μL含人表皮类器官悬液，使嵌入皿内外液面相平； （注：加入细胞悬液后，不要移动培养板，在超净台内静置10min后再平稳移至37°培养箱，确保细胞均匀分布；） 

10. 将培养板静置于37℃ CO2培养箱中24h，待细胞贴壁后，弃掉嵌入皿内层及培养板中的培养基，并用预热的DPBS轻柔清 洗嵌 入皿内层细胞3次，去除未贴壁的类器官； 

11. 添加450L 预热的人类器官重组表皮培养基至嵌入皿外部，使液面与内层底面相平，进行气液培养; 

12. 每2天更换人类器官重组表皮培养基，气液培养21天;（ 注：观察嵌入皿上层是否含有液体，及时弃掉液体） 

13. 气液培养21天后，可通过垂直切片对其进行鉴定。 

五、模型维持培养

1. 添加450 μL 预热的人类器官重组表皮培养基至嵌入皿外部，使液面与内层底面相平，进行气液培养;

2. 每2天更换人类器官重组表皮培养基，继续气液培养（ 注：观察嵌入皿上层是否含有液体，及时弃掉液体）。

五、刺激性测试

1、准备工作

1. SDS溶液配制：使用蒸馏水配制5%SDS，并 进行过滤。

2. 噻唑蓝母液配制：使用DPBS配制5mg/mL 噻唑蓝贮存液，避光贮存于-20℃。 

3. 噻唑蓝工作液配制：使用

2、给药处理

1. 选取完整人类器官重组表皮模型并进行分 组：正常组给药蒸馏水、阳性组给药5%  SDS和待测药物组，每组至少3个复孔。 

2. 弃掉旧的培养基，更换新鲜人类器官重组表 皮培养基。 

3. 在对应组别小室内层中心位置分别加入相应 蒸馏水、5%SDS和药物溶液各8μl，轻轻晃 动模型，使液体均匀润湿表皮模型表面。 

4. 将模型静置于室温，给药干预15min。

 5. 使用10μl枪头沿小室边缘吸掉药物，使用常 温DPBS轻柔清洗模型表面3次，注意操作 过程中尽量不要触碰模型表面。 

6. 弃掉小室外层培养基，更换新鲜人类器官重 组表皮培养基，将模型放置于37℃，5%  CO2培养箱孵育42h，使其恢复状态，再进 行细胞活力噻唑蓝检测。

3、细胞活力检测——噻唑蓝处理

1. 在小室外层添加500μL噻唑蓝工作液，内层添加100μL噻唑蓝工作液。

2. 37℃，5%CO2条件下进行孵育3h。 

3. 噻唑蓝孵育结束后，轻轻弃掉小室内外层噻唑蓝工作液。 

4. 使用镊子夹取小室内模型放置于96孔平底细胞培养板。 

5. 每孔加入异丙醇300μL，多次吹打使其充分混匀。 

6. 并于96孔板加300μL异丙醇，作为空白对照。 

7. 37℃孵育3h。

 8. 孵育结束后，再次吹打，使蓝紫色结晶甲臜完全溶解并混匀。从每孔中吸取200μL异丙醇浸提液，各自加入96孔板的对应孔 中，做好分组标记。 

9. 于酶标仪570nm波长读取吸光度（OD）值。按以下公式计算相对细胞活力。相对细胞活力=（样品组OD值-空白对照OD值）/ （阴性对照OD值-空白对照OD值）*100%。 

10. 细胞活力大于等于50%的化合物为非刺激性化合物；细胞活力小于50%的化合物为刺激性化合物。