干细胞培养

时间:2021-09-23浏览次数:2110

干细胞(Stem cell)即起源细胞。在细胞的分化过程中,细胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力,最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足,保留了一部分未分化的原始细胞。因此,干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

  • 能自我更新和分化

  • 具自我复制的能力

  • 能在一定条件下分化成具有特定形态和功能的成熟细胞

 

2、胚胎干细胞

  • 从囊胚期胚胎的内细胞团获得

  • 胚胎生殖细胞与胚胎干细胞都可自发分化形成三胚层的全部细胞

 

3、成体干细胞

  • 特定的组织中

  • 能自我更新并分化成相应组织内具有特定功能的成熟细胞

  • 可塑性




一、培养条件

1. 环境:细胞培养需要一个无菌的环境,所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统, 能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。

2. 设备:二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。

3. 实验耗材:一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。

4. 试剤:干细胞对培养条件要求较高,可以根据自己的条件,尽量选用质量好的各种试剤。


试剤的配制:

① DMEM培养基:去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3

② MEF培养基:DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml青莓素,1000g/ml链霉素

③ ES培养基:ES培养基:DMEM培养基中含15% FBS, 1000u/ml青莓素,1000g/ml链霉素,1mM丙桐酸钠,0.1mM非必须氨基酸,2mM谷氨酰胺,0.1mM筑基乙醇,1000u/ml白血病抑制因子

④ D-Hank's: 0.8%NaCI,0.04%KCI, 0.035%NaHC03, 0.006%KH2P04,0.005325%Na2HP04, 0.001% 酚红

⑤ 0.1%明胶:D-HanK's溶液中含0.1%的明胶

⑥ ES细胞冻存酒:90% ES培养基,10% DMSO

⑦ MEF细胞冻存酒:90% MEF培养基,10% DMSO

⑧ Feeder 细胞冻存酒:90% FBS , 10% DMSO

⑨ 丝裂莓素C:根据产品说明书来配制


二、培养步骤
常见的干细胞培养是胜胎干细胞(ES cells)培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。


1. 小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF)的复苏

胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下,生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中(此处以细胞培养皿为例)。因此要先铺滋养层细胞。

① 在37P水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。

② 把融化的细胞悬浮酒加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中,轻轻混匀后,1000xg , 5min离心收集细胞。

③ 吸掉上清(除去冻存酒中的DMSO),用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后,加到一个10cm的细 胞培养皿中,放入37℃,含有5%CO2的加湿培养箱中培养。

④ 根据情况对细胞进行换液,大约4天左右,细胞就可以基本长滴整个培养皿,这时可以进行传代、冻存 或用于制备滋养细胞层。

 

2. 滋养细胞层(feeder cells layer)的制备

① 把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉,加入10ml新鲜的MEF培养基,并在避光的条件下加入 110μL配好的丝裂莓素C,混匀后放入培养箱培养2h。

② 把含有丝裂莓素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存,在一周之内可再次使用(直接使 用该培养基处理细胞5hh。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后,用1ml含有EDTA的胰酶消 化细胞,37°C培养箱放置约3min,直到细胞悬浮起来。

③ 用1ml MEF培养基中和胰酶的作用,之后把细胞收集到离心管里,1000xg离心5min。

④ 去掉上清,用1ml MEF培养基重悬细胞,之后把细胞平均分到两个经过0.1 %明胶处理过的细胞培养皿 中,用MEF培养基培养细胞。(明胶处理:加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中,在37°C培养箱中至少 放10min,之后把明胶吸掉即可)

⑤ 一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁,形成滋养细胞层,这时的滋养细胞层即可 用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间,或者是把 细胞冻存。

 

3. 小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, ES cells)的复苏

① 在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。

② 把融化的细胞悬浮酒加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中,轻轻混匀后,1000xg , 5min 离心收集细胞。

③ 吸掉上清(除去冻存酒中的DMSO,用10ml预热的ES培养基重悬细胞后,加到一个10cm的铺有滋 养细胞层的细胞培养皿中,放入37°C,含有5%CO2的加湿培养箱中培养。

④ 根据情况对细胞进行换液,大约3~4天左右,细胞就可以基本长滴整个培养皿,这时可以进行传代、冻 存或用于后续试验。

 

4. 小鼠胚胎干细胞的传代

① 吸掉培养基,用PBS(不含二价离子)洗2~3次后,加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞,37℃培养箱放 置约5min,直到细胞基本悬浮起来。

② 用1ml ES培养基中和胰酶的作用,之后把细胞收集到离心管里,1000xg离心5min。

③ 去掉上清,用几毫升ES培养基重悬细胞,之后根据培养皿规格和分配比,把细胞按一定比例分到铺有 滋养细胞层的细胞培养皿中,加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。

 

5. 小鼠胚胎干细胞的冻存

① 吸掉培养基,用PBS(不含二价离子)洗2~3次后,加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞,37°C培养箱放 置约5min,直到细胞基本悬浮起来。

② 用1ml ES培养基中和胰酶的作用,之后把细胞收集到离心管里,1000xg离心5min。

③ 去掉上清,用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞(冻存液的量视冻存的细胞量来定,一般 一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管),按每管1 ml的量分装到冻存管中。梯度降温:4°C20min, -20°C20min, -80°C过夜后迅速转入液氮中。


三、注意事项
1. 丝裂莓素C在操作时要避光,避免其分解。
2. ES细胞倾向于聚集生长,因此在复苏时,要选择好培养皿的规格
3. ES细胞不能长的太满,应避免使各个克隆之间接触,以免发上分化。
4. 为避免水或血清帯来的污染,对血清应进行支原体检测,配好的培养基要进行污染测试。


晶莱生物服务流程


晶莱生物实验服务项目

动物实验细胞生物学病理实验
消化系统模型细胞培养病理染色
胃酸分泌模型普通细胞株HE染色
脓毒症模型细胞缺氧培养油红O染色
胃溃疡模型细胞培养+支架番红固绿染色
胰腺炎模型干细胞培养Masson染色
肝纤维化模型原代细胞分离/提取/培养天狼猩红染色
DIO肥胖模型细胞转染/病毒感染PAS糖原染色
胆结石模型Trans well共培养阿利新蓝染色
结肠炎(UC)模型细胞增殖甲苯胺蓝染色
脂肪肝模型细胞计数尼氏染色
急性肝损伤模型生长曲线测定LFB髓鞘染色
免疫、代谢系统疾病模型存活曲线测定普鲁士蓝染色
骨质疏松模型ccK-8增殖检测VG染色
糖尿病模型MTT增殖检测EVG染色
高尿酸血症模型CFSE检测增殖-流式检测VonKossa染色
呼吸系统模型BrDU检测-免疫荧光法刚果红染色
肺纤维化模型细胞凋亡苏丹黑B染色
慢性肺阻塞模型Annexin V/PI流式检测细胞凋亡Trap染色
急性肺损伤模型WB检测凋亡相关蛋白抗酸染色
哮喘模型透射电镜观察凋亡小体革兰氏染色
肺栓塞模型Tunel染色(POD法,DAB显色)AB-PAS染色
支气管炎模型Tunel(荧光法,含试剂盒)亚甲基蓝染色
泌尿生殖系统模型DNA ladder法苯胺蓝染色
慢性肾衰模型细胞周期荧光 DAPI染色
急性肾衰模型细胞显微计数普鲁士蓝染色
肾间质纤维化模型PI染色间苯二酚碱性品红染色
肾结石模型BrdU渗入法银染
肾炎模型免疫荧光染色黑色素染色
子宫内膜异位症模型PI流式检测细胞周期镀银染色
心血管系统模型细胞运动PASM 六胺银染色
冠心病模型Transwell检测细胞迁移VG染色
心肌梗死模型Transwell检测细胞侵袭富尔根染色
心脏骤停模型细胞划痕亚甲基蓝染色
慢性心力衰竭模型细胞克隆碘-碘化钾染色
动脉粥样硬化模型集落形成法/稀释铺板方法Goldner三色法染色
白血病模型软琼脂克隆法PAS-萘酚磺S染色
高血压模型毛细管克隆法改良苯酚品红染色
神经系统模型体外实验血管生成网状纤维染色
脑卒中模型磁珠分选细胞β-半乳糖苷酶染色
栓塞性脑梗死模型流式分选细胞镀银染色
脑出血模型开机费movat五色染色
脑损伤模型单色维多利亚蓝染色
脊髓损伤模型双色免疫组化
帕金森模型CBA多细胞因子流式检测免疫组化预式
老年痴呆模型组织/血液细胞制备免疫组化正式
应激模型组织单细胞制备免疫荧光(石蜡-单标)
骨骼疾病模型中性粒细胞提取免疫荧光(石蜡-双标)
骨折模型其他样本细胞制备(如血液等)免疫荧光(石蜡-三标)
骨缺损模型外周血PBMC分离免疫荧光(冰冻-单标)
风湿免疫性关节炎模型线粒体组学免疫荧光(冰冻-双标)
骨关节炎模型线粒体膜电位检测-流式法制片前处理
五官疾病模型线粒体膜电位检测-免疫荧光法石蜡组织包埋
眼科疾病模型线粒体ROS生物含量检测--流式特殊包埋(细胞、材料、眼球等)
鼻腔疾病模型线粒体ROS生物含量检测--免疫荧光软化(肝硬化、皮肤结痂、植物等)
皮肤疾病模型线粒体通透性转换孔(mPTP)骨组织脱钙(小)
皮肤损伤模型溶酶体免疫荧光法骨组织脱钙(大)
肿瘤疾病模型线粒体+溶酶体共定位骨组织EDTA脱钙(小)
原位瘤模型内质网骨组织EDTA脱钙(大)
转移瘤模型线粒体钙瞬时变化检测-流式石蜡白片
皮下植瘤模型ATP检测细胞爬片

ADP检测

AMP检测



流式DNA/RNA半定量检测基因编辑工具
组织细胞悬液处理pcr检测mRNA合成(3保1)片段/质粒/引物合成
细胞处理microRNA检测质粒载体构建
血液标本处理LncRNA表达量的检测过表达腺病毒载体构建包装
细胞刺激培养CirRNA表达量的检测shRNA腺病毒载体构建包装
单色检测凝胶电泳过表达慢病毒载体构建包装
双色检测基因合成shRNA慢病毒载体构建包装
Annexin V/PI凋亡<300过表达腺相关病毒载体构建包装
细胞周期300-1,500shRNA腺病毒载体构建包装

1500 - 5000稳转细胞株

>5000

特殊序列



ELISAWBqPCR
组织匀浆处理蛋白提取及定量一RNA抽提
ELISA(不含试剂盒)48T/kitWB检测一(10孔膜/指标)mRNA引物设计及合成
ELISA(不含试剂盒)96T/kit灰度值分析及作图一(10孔膜/指标)miRNA引物设计及合成
ELISA(含国产试剂盒)48T/kit蛋白提取及定量二LncRNA引物设计及合成
ELISA(含国产试剂盒)96T/kitWB检测二(15孔膜/指标)CircRNA引物设计及合成

灰度值分析及作图二(15孔膜/指标)mRNA RT-qPCR


miRNA RT-qPCR


LncRNA RT-qPCR


CircRNA RT-qPCR


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