标准化实验Protocol：肝脏类器官（HML）MASLD模型构建及药物性肝损伤（DILI）评价全流程参照！

本模型由：分化HepaRG肝细胞（80%）、LX-2肝星状细胞（10%）、原代人M1型巨噬细胞（10%）3种细胞无支架共组装形成三维人肝类器官（命名HML）；

通过硬脂酸+油酸复合脂质慢性暴露诱导复现MASLD（原NAFLD）脂肪变性、炎症、纤维化三联病理特征，可用于健康肝脏与脂肪肝病理背景下的药物肝毒性高通量/多组学评价。

培养平台可选：

①96孔超低吸附（ULA）板：单孔单类器官，适配高通量药物筛选、原位成像、细胞活力检测；

②琼脂糖微模具：每模具35个类器官，批量收集样本，适配转录组/蛋白组/代谢组、流式、药物代谢定量。

方案1：分化型HepaRG肝细胞培养

① 完全培养基配制（500mL）

威廉姆斯E+GlutaMAX基础培养基+1×青链霉素+5μg/mL胰岛素+50μM氢化可的松半琥珀酸酯+10%胎牛血清（FBS）

②传代扩增：T75瓶接种密度2×10⁶细胞/瓶，常规胰酶消化传代。

③长达28天梯度分化（核心步骤）

D0~14：基础完全培养基培养

D14：更换含1%DMSO培养基

D16：更换含1.5%DMSO培养基

D18~28：更换含1.7%DMSO培养基，每2天换液；D28分化完成，可用于类器官共接种。

④替代简化方案：商品化冻存分化HepaRG细胞，直接复苏使用，省去28天分化周期。

方案2：LX-2人肝星状细胞培养

①完全培养基（500mL）

DMEM+GlutaMAX+1×青链霉素+2%FBS（维持静息表型；10%FBS可诱导活化）

②传代扩增：T75瓶接种2×10⁶细胞/瓶，胰酶消化每周传代，无需分化，扩增后直接用于共培养。

方案3：原代人未刺激M1巨噬细胞制备

①从人血白膜层Ficoll密度梯度分离PBMC；

②CD14免疫磁珠阳性分选单核细胞；

③单核细胞培养基（RPMI+10%FBS+GM-CSF50ng/mL）培养7天，每2天换液，分化为成熟M1巨噬细胞；

④可选：商品化冻存预分化人巨噬细胞复苏直接使用，缩短操作时长。

通用细胞配比与细胞悬液统一标准

三类细胞分别消化、离心，用细胞接种培养基重悬至统一浓度1×10⁶cells/mL；

单颗类器官总细胞数2000个，固定比例：

HepaRG：1600cells（80%）

LX-2：200cells（10%）

M1巨噬：200cells（10%）

分支A：96孔超低吸附（ULA）板（高通量药物筛选平台）

①混合细胞悬液配制：每孔终体积100μL，含上述2000个混合细胞；整板96孔总悬液10mL（预留10%死体积）；

②每孔加入100μL细胞混合液，37℃、5%CO₂孵箱静置培养；

③类器官维持换液规则（周一/三/五统一换液）：

D0~5：培养基含5%FBS；每孔吸弃50μL旧培养基，沿壁补50μL新鲜培养基；

D5之后：更换为1%FBS类器官维持培养基；

D14类器官完全成熟，可开展脂质造模或药物毒性干预。

分支B：琼脂糖微模具（多组学大样本平台）

①无菌琼脂糖模具制备：2%琼脂糖PBS溶液60~70℃浇筑微模具，冷却凝固后转移至24孔板，培养基平衡过夜；

②每模具总细胞悬液70μL（35颗类器官/模具，共70000细胞），室温静置20min使细胞沉降至微孔；

③每孔沿壁添加500μL10%FBS接种培养基，入孵箱；

④维持换液同ULA板：D0~55%FBS，D5后更换1%FBS维持培养基；D14成熟可用。

1.脂肪酸-BSA工作液预制（硬脂酸+油酸混合液）

①储备液配制

5mM硬脂酸母液、10mM油酸母液，乙醇溶解后0.1MNaOH70℃皂化；

与无脂肪酸BSA56℃复合，-20℃避光保存；同步制备不含脂肪酸的BSA溶剂对照。

② 造模工作培养基现配现用：成熟类器官（D5起处理）培养基中添加脂肪酸至终浓度：150μM硬脂酸+300μM油酸。

2.完整9天脂质诱导造模时序（总培养周期14天）

①类器官接种D0~D3：10%FBS接种培养基培养；D3：更换为含1%FBS基础维持培养基；

②D5（造模启动点）：分为两组：

对照组（CTL）：添加同等浓度空白BSA培养基；

MASLD造模组：添加150μM硬脂酸+300μM油酸复合脂肪酸培养基；

③持续脂质暴露至D14，累计脂质处理9天；

14收获类器官，模型表型验证：胞内脂质蓄积、促炎因子上调、纤维化标志物（α-SMA、Ⅰ型胶原）升高、Ⅰ/Ⅱ相代谢酶功能受损，完全复现MASLD脂肪变性+慢性低度炎症+早期纤维化病理特征。

3.类器官收集方法

ULA96孔板：单孔P200移液枪吸取单颗类器官，PBS洗涤后合并收集；

琼脂糖模具：模具倒置离心（200×g，5min）释放全部类器官，批量收集，PBS洗涤备用。

1.干预时间窗口选择

①健康肝脏毒性评价：类器官D5成熟后，直接加入梯度浓度药物处理，无脂肪酸共暴露；

②脂肪肝背景DILI评价：D5同步添加脂肪酸造模+梯度浓度受试药物，共处理9天至D14；

核心优势：区分「正常肝脏药物毒性」与「脂肪肝易感型药物肝损伤」。

2.梯度给药设计

设置空白BSA对照、溶剂对照、5~8个对数梯度药物浓度，平行复孔；96孔ULA板适配高通量梯度筛选，计算IC₅₀、基准剂量BMD。

3.终点检测指标全套操作

①细胞活力定量（高通量首选，ULA板专用）

发光/荧光/比色法活死细胞试剂盒，原位检测单孔类器官活力，定量药物细胞毒性。

②病理形态学验证

类器官固定、切片：HE染色（脂滴空泡）、油红O染色（中性脂质定量）；免疫荧光染色：HepaRG肝细胞、α-SMA（星状细胞活化/纤维化）、促炎巨噬标志物。

③分子水平毒性评价（琼脂糖模具批量取材）

RT-qPCR：肝损伤标志物、纤维化基因（COL1A1、α-SMA）、炎症因子（TNF-α、IL-6）、Ⅰ/Ⅱ相代谢酶（CYP450家族）；

多组学：RNA-seq转录组、蛋白组、代谢组，解析药物致脂变、炎症、纤维化分子通路；

流式细胞术：解离类器官为单细胞，分群定量肝细胞/星状细胞/巨噬细胞凋亡、活化比例；

④药物代谢功能评价

收集培养上清，LC-MS定量药物及其代谢产物，评估脂肪肝状态下肝脏代谢酶功能改变对药物清除、毒性代谢物生成的影响。

4.数据统计与毒理评价标准

①计算半数抑制浓度IC₅₀、基准剂量BMD，量化药物肝毒强度；

②对比健康HMLvsMASLD-HML两组毒性差异，判定脂肪肝是否增加药物肝损伤风险；

③多组学联合解析药物致脂肪变性、炎症、纤维化的分子机制。

1.药物肝毒性（DILI）相关研究

①新药临床前肝毒性高通量筛选：

96孔ULA平台可大批量梯度给药，快速区分具有潜在肝损伤风险的化合物，替代部分动物急性毒性实验，属于毒理学新方法学（NAMs）。

②脂肪肝易感型药物肝损伤机制研究

可复现临床常见现象：MASLD患者服用药物后肝损伤风险显著升高；可明确脂质蓄积、慢性低度炎症如何放大药物毒性、促进毒性代谢产物蓄积。

③剂量-毒性关系与安全剂量界定

通过IC₅₀、基准剂量（BMD）定量药物肝毒阈值，优化临床给药安全窗口。

④药物代谢酶与毒性代谢物研究

模型保留完整CYP450Ⅰ/Ⅱ相代谢酶活性，可评估脂肪肝状态下代谢酶表达改变对药物活化/解毒的影响，解释特异质性药物肝损伤。

⑤抗肝损伤候选药物药效评价

在MASLD造模体系中同步给药，评价受试化合物缓解药物诱导肝细胞凋亡、星状细胞纤维化、巨噬细胞炎症的保护作用。

2. 代谢相关脂肪肝（MASLD/NAFLD）基础与转化研究

①MASLD病理三联征机制研究

同时包含肝细胞（脂质蓄积）、肝星状细胞（纤维化启动）、巨噬细胞（慢性炎症）三类核心功能细胞，可解析细胞间互作通路：脂质过载如何介导巨噬细胞促炎激活、进而诱导星状细胞活化与胶原沉积。

②不同游离脂肪酸、代谢应激诱导脂肪变性的对比研究

可替换脂肪酸种类、浓度、暴露时长，构建轻/中/重度脂肪变性模型，模拟不同分期MASLD。

③MASLD进展相关靶点筛选与验证

转录组/蛋白组/代谢组多组学挖掘脂变、炎症、纤维化关键调控基因/通路，结合药物干预反向验证靶点功能。

④抗MASLD新药药效评价

用于筛选改善肝脂沉积、抑制肝脏炎症、阻断早期肝纤维化的候选药物，评价化合物延缓/逆转脂肪性肝炎的作用。