【cells】患者来源 MASLD 肝脏类器官构建方法论！

MASLD类器官包含3种组织来源：健康肝组织、脂肪变性肝组织、肝硬化肝组织，源自外科手术无瘤肝标本。

1.组织采集完整流程

①手术台上获取标本：外科医师切取无瘤肝组织小块；

②离体后快速转移，冰浴条件转运；

③实验室处理：剪碎组织，冰DMEM（4.5g/L葡萄糖）洗涤2次，去除血液、脂肪碎屑；

④后续进入组织消化步骤（归入类器官构建流程）。

2.组织采集关键注意事项

①组织体积限制：微创手术切除标本整体偏小，经常出现可用于科研的肝组织量不足，207例手术中88例微创手术、34例开腹手术因组织量太少无法建类器官；微创手术虽然对患者友好，但类器官建系成功率显著受取材量制约。

②标本离体时间因素：夜间、周末手术，标本处理延迟，是组织报废重要原因，30例移植手术因周末/夜间处理延迟，部分样本建系失败。

③微生物污染风险：

肝组织毗邻胆管，肝内胆管来源细菌污染是建系失败重要原因，本研究55例入组样本约20%不能形成类器官，其中3例明确胆管细菌污染。

对策：放弃传统青霉素‑链霉素，培养基更换广谱抗生素美罗培南；仍存在1例多重耐药菌污染无法挽救。

④病例基线异质性：

入组患者基线差异大：年龄、BMI、MASLD评分、FIB‑4纤维化指数、MELD评分跨度大；分为健康、脂肪变性、肝硬化三组，肝硬化组MELD、FIB‑4显著升高，组织纤维化程度高，后续消化、生长表型会自带患者个体异质性。

提示：实验需要记录患者MASLD/FIB‑4/MELD临床指标，用于后续类器官表型和原组织临床特征关联分析。

1.组织消化制备细胞悬液：

①肝组织剪碎成细小组织碎块；冰DMEM洗涤2次，弃上清。

加入消化液：AdvancedDMEM/F12+2.5mg/mL胶原酶D+0.1mg/mLDNaseI。

②振荡孵育消化；消化结束后，70 μm细胞筛过滤，冰DMEM洗涤。

③离心得到细胞沉淀。

关键细节：沉淀含有大量红细胞、细胞碎片，本方案不做细胞计数，红细胞死碎片不具备类器官形成能力。

2.基质胶包埋接种

①细胞沉淀重悬于Geltrex基质胶；24孔板，每孔50 μL基质胶‑细胞混合液，做成胶滴（dome）。接种时胶滴内细胞密度约20%。

②37℃孵箱30 min，使Geltrex完全凝固。

3.培养基与换液时序

①凝固后加入类器官启动培养基：激酶抑制剂；每孔500 μL。

②每3天换液一次。

③第7天更换为类器官生长培养基：去掉ROCK抑制剂。

4.传代操作（1:1传代比例）

传代触发条件：孔内类器官密度过高/单个类器官直径＞1 mm。

①刮下胶滴，转移到含基础培养基离心管。

②4 ℃，140 × g，离心5 min。弃去大部分上清，保留≤2 mL。

③使用22G针头注射器反复吹打3‑5次，机械破碎类器官成细胞小团块。

④再次离心，沉淀重新用Geltrex重悬，铺胶滴，继续培养。

5.培养阶段注意事项

①抗生素：全程用美罗培南替代青链霉素，对抗胆管来源细菌污染；警惕多重耐药菌。

②传代稳定性：P2‑P4成功率稳定82%；P6之后活力下降至76%；长期实验建议控制在≤P4代。

③脂肪变性类器官局限：文献中的方案培养基未额外添加游离脂肪酸，体外不会复现脂肪沉积；如需模拟脂肪变性表型，后续需要补加脂肪酸处理。

④计数局限：红细胞碎片干扰，无法活细胞计数；未来可引入Hoechst染色区分活细胞/碎片优化定量。

分为三大模块：形态学明场观察、多重免疫荧光、qPCR基因表达（mRNA水平）、延时成像+数学生长动力学建模。

1.明场形态学观察

①观察时间点：d0、d6、d9、d12、P1d4、P2d4；比例尺200 μm。

②形态特征：早期致密小细胞团，逐步长成边界清晰中空囊泡样3D类器官；健康/脂肪变性/肝硬化来源类器官光学形态肉眼无明显形态差异，不能依靠明场区分疾病表型，必须分子标志物检测。

2.FFPE包埋、多重免疫荧光检测（蛋白表型）

样本处理流程：福尔马林固定类器官胶滴→琼脂糖预包埋→石蜡包埋，切片2.5 μm；多重TSA荧光染色。

2.1核心结果

①增殖Ki‑67：三组类器官Ki‑67阳性细胞均约40%，健康/脂肪变性/肝硬化之间无统计学差异（ns）；提示体外培养后增殖水平趋于一致。

②肝细胞标记：

HNF4α：健康、脂肪变性约60%阳性；肝硬化类器官下降至约50%（无统计学差异）。

Albumin：有趣现象：Ki‑67增殖阳性细胞同时表达白蛋白；体内肝脏中白蛋白只在终末分化非增殖肝细胞表达，类器官存在这种“增殖+肝细胞功能蛋白共表达”的体外特征。肝硬化、脂肪变性组白蛋白阳性略高于健康组。

③胆管标记CK19：三组均高表达；说明这套患者来源类器官具备双潜能祖细胞特征，同时携带肝细胞、胆管细胞表型。LGR5仅局灶散在阳性，不是全群阳性。

④纤维化标志物（Collagen‑I、α‑SMA）【本研究最核心疾病相关表型】：

可见：从健康→脂肪变性→肝硬化，Collagen‑I、α‑SMA阳性细胞比例逐步上升，肝硬化组显著高于健康组，p<0.05。

关键价值：体外类器官保留了原供体肝组织的纤维化疾病表型，这是该模型用于MASLD研究最重要证据。

局限：每组n=3技术重复；个体病人异质性大，需要扩大类器官株数量。

3.qPCRmRNA水平检测

检测靶标：HNF4A(肝细胞)、ALB(白蛋白)、MKI67(Ki‑67)、LGR5(祖细胞)；内参：36B4、GAPDH；对照HepG2细胞。

核心结果：

①HNF4A：患者间高度异质性；肝硬化来源类器官一致性下调；HNF4A高低代表肝细胞分化程度，高表达更接近成熟肝细胞，低表达提示去分化/未成熟状态。

②ALB：所有类器官相比HepG2均下调，部分样本低于检出限。

③LGR5：全部类器官轻度上调，和免疫荧光局灶LGR5蛋白阳性对应。

④MKI67：大部分样本增殖基因下调，仅个别健康株上调。

提示：蛋白水平和mRNA不完全一一对应；反映体外类器官处在不完全成熟的祖细胞样状态，存在很强病人来源异质性。

4.延时成像+数学建模：生长动力学

文献独创定量评价手段，通过延时拍照测半径，计算类器官表面积，拟合线性、指数数学模型。

生长模式为双相（多阶段）生长：

①0‑15~20 h：线性生长阶段；

②过渡转换期（小于1次群体倍增，表面积增加约25%）；

③30‑72 h：指数生长；群体倍增时间约20.6‑34.6 h。

科学意义：传统类器官研究只做终点观察；文献的模型可以定量刻画类器官动态增殖行为，未来可以用于药物处理后生长动力学的定量药效评估，支撑精准药物筛选。

1.可同时构建健康、脂肪变性、肝硬化 MASLD 谱系类器官，建系成功率高；可传代；保留原组织纤维化表型。

2.建立蛋白、转录、生长动力学多维度评价平台，适合 MASLD 疾病机制、药物测试。

局限

1.体外体系缺少肝脏其他原生细胞：库普弗细胞、肝窦内皮细胞；类器官以祖细胞 / 肝细胞‑胆管双潜能细胞为主。

2.脂肪变性类器官培养基不加脂肪酸，体外不会自发形成脂滴，需要额外造模。

3.传代到 P6 之后培养活力下降；实验尽量使用 P2‑P4 代。

4.存在很强患者个体异质性，单株类器官不能代表全部疾病人群，需要多株类器官重复。

5.白蛋白 mRNA 整体下调，体外肝细胞成熟度有限。

参考文献：From Patient Liver Tissue to Organoids: Establishment of a Translational Platform Using Healthy, Steatotic, and Cirrhotic Tissue Sources